PH0316 | RIPA裂解液(强) RIPA Lysis Buffer (Strong)

货号 PH0316

名称 RIPA裂解液(强) | RIPA Lysis Buffer (Strong)

存储 常温运输，2～8℃保存，有效期12个月

注意：如发现RIPA有沉淀，请放室温半小时或者常温水浴使沉淀溶解。

根据使用量，取每1ml RIPA 加入10ul PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，混匀备用 （PMSF现用现加）。

产品描述 

RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP和ELISA等。

RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。

RIPA裂解液(强)的主要成分为50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白降解。

用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用PHYGENE的BCA蛋白浓度测定试剂盒(PH0326)测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

使用说明 

(一) 贴壁培养细胞：

1、 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 室温溶解混匀， 加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。

2、 去除贴壁细胞的培养液，用 PBS、 NS 或无血清培养液清洗 1 次，低速离心，弃上清，留取沉淀。

3、 按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例， 加入RIPA Lysis Buffer 。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或 4℃裂解 15～30min，通常裂解液作用于细胞 1～3 秒内，细胞就会被裂解。通常 6 孔板每孔细胞加入 150μl 裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200～250μl。

4、 充分裂解后，10000～12000g，4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

5、 进行后续的 SDS-PAGE、 Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)悬浮培养细胞

1、 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 室温溶解混匀，加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。

2、 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

3、 用手指轻弹细胞，使其松散。按照 6 孔板每孔细胞加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 Enhanced RIPA Lysis Buffer。通常 6 孔板每孔细胞加入 150μl 裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200～250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

4、 10000～12000g，4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、 进行后续的 SDS-PAGE、 Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

（三）组织样品：

1、 取 Enhanced Lysis Buffer 置于室温溶解混匀 ， 加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。

2、 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。 取在液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在 1～2min 之内，以减少蛋白的降解。

3、 按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解 15-30min。

4、 步骤 3、 4 亦可以采用如下过程：按照每 20mg 组织加入 150～250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的 Enhanced RIPA Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在 1～2min 之内，以减少蛋白的降解。

5、 10000～12000g，4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

6、 进行后续的 PAGE、 Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事项 

1、 去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。

2、 如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

3、 如果细胞量较多，必需分装成 50～100 万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

4、 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈 Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。

5、 溶解 RIPA Lysis Buffer 时，应尽量缩短溶解时间，避免有效成分失效。

6、 裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA 等的复合物。在不检测和基因组 DNA 结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如 NF-KB、 p53 等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

7、 细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或 4℃进行。

8、用户使用前需可根据需要再加入leupeptin，aprotinin等其它抑制剂。

Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA buffer) is a lysis buffer used to lyse cells and tissue for the radio immunoprecipitation assay (RIPA). This buffer is more denaturing than NP-40 or Triton X-100 because it contains the ionic detergents SDS and sodium deoxycholate as active constituents and is particularly useful for disruption of nuclear membranes in the preparation of nuclear extracts. The RIPA buffer gives low background but can denature kinases.