产品名称 : | PH0324 | 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒 Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit |
产品品牌 : | 飞净 PHYGENE |
Catalog No:PH0324
Size:50T | 100T
有效期:12个月
存储 冰袋运输,有效期12个月,核/浆蛋白抽提试剂 4℃保存,PMSF 于-20 ℃保存。
产品简介
本试剂盒提供了一种简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提核蛋白的方法。整个过程只需约 60 分钟 就可以将核蛋白和浆蛋白从细胞中分离出来。得到的蛋白可以用于 Western blot 等实验。本试剂盒通过浆蛋白 抽提试剂使细胞膨胀破裂,释放出胞浆蛋白,再通过离心得到细胞核。然后通过核蛋白抽提试剂抽提得到细 胞核蛋白。本试剂盒可以抽提 50/100 个样品(每个样品约 2×106个 Hela 细胞,40mg)。
Components |
50T |
100T |
Storage |
浆蛋白抽提试剂 |
25 mL |
50 mL |
4℃ |
核蛋白抽提试剂 |
5 mL |
10 mL |
4℃ |
PMSF(100mM) |
300ul |
1 mL |
-20℃ |
操作步骤
裂解蛋白的所有步骤都需在冰上或 4℃进行。
一、对于体外培养细胞:
1.根据用量取适当的浆蛋白抽提试剂和核蛋白抽提试剂加入 PMSF,使 PMSF 的最终浓度为 1mM。PMSF 需现用现加,若目标蛋白含有丰富的半胱氨酸,可以在两种蛋白抽提液中加入 DTT 至终浓度 0.5mM。
2.对于贴壁细胞,去除培养液,用 PBS 洗一遍,用细胞刮刀收集细胞,或用 EDTA 消化后吹打下细胞(最 好不用胰酶硝化,以免胰酶消化目的蛋白)。500 g 离心 2~3 分钟收集细胞,吸尽上清留下沉淀备用。
3.对于悬浮细胞:用 PBS 洗一遍,500 g 离心 2~3 分钟收集细胞,吸尽上清,留下细胞沉淀备用。
4.每 20ul 细胞沉淀加入 200ul 浆蛋白抽提试剂(2×106 个细胞沉淀约 20ul 或 40mg)。
5.用移液器吹打或高速涡旋 15 秒(可适当延长),必须使细胞沉淀完全分散开成单细胞悬液。细胞沉淀分散 不完全会导致蛋白产量降低。
6.冰浴 10 分钟。
7.最高转速剧烈涡旋 10 秒,4℃ 12000~16000g 离心 10 分钟。
8.上清即为抽提得到的细胞浆蛋白,立即吸取上清至预冷的样品管中备用,进行后续的 PAGE、Western 等 实验,但蛋白浓度较低,可根据需要进行相应浓缩。
9.沉淀即为细胞核,要完全吸尽残余的上清(避免细胞浆蛋白的污染),加入 50-100ul 核蛋白抽提试剂。
10.用移液器吹打或高速涡旋 15 秒(可适当延长)至沉淀完全分散,冰浴 10 分钟。
11.最高转速剧烈涡旋 10 秒,4℃12000~16000g 离心 10 分钟。
12.立即吸取上清至预冷的样品管中,此即为抽提得到的细胞核蛋白。可进行后续实验或-70℃冻存。
对于组织样品: 把组织称重后,尽可能切成非常细小的碎片,按每 50mg 组织加入 200ul-500ul PBS,用匀浆器冰上匀浆 制成细胞悬液,500 g 离心 2~3 分钟收集细胞,吸尽上清,收集沉淀。加入 200ul 浆蛋白抽提试剂后接上述步骤 5。
注意事项
1.裂解得到的蛋白样品,由于含有较高浓度的去垢剂干扰,不能用 Bradford 法测定蛋白浓度,可以选用本公 司生产的 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
2.对于组织样品,本试剂盒适用于新鲜组织,对冻存组织抽提效果较差。
3.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
温馨提示:1.本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗,食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。2.为了您的安全和健康,请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。3.实验结果可由多种因素影响,相关处理只限于产品本身,不涉及其他赔偿。
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